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重庆荧光显微镜的原理及应用要点
- 2019-02-19 -

   重庆荧光显微镜是利用特定波长的光照射被检物体产生荧光进行镜检的显微光学观测技术,已有100多年历史。近年来,由于免疫荧光在医学研究、诊断领域里的广泛应用,FISH、绿色荧光蛋白(GFP)技术分别在基因组学、蛋白质组学研究方面的推广,显微照相、数字CCD成像技术的辅助驱动,赋予这一传统技术更新的应用价值和生命力。

基本原理

   荧光:是一种非温度辐射冷光,据发生性质可分为光化荧光(由特定光源光谱激发而产生的荧光)、放射荧光(放射性物质激发)、生物荧光(生物体发出)、化学荧光(如磷氧化时)等。

   荧光现象:某物质在受到某种特定波长的高能量光(短波长)照射后获取能量,几乎即时(约在10~15s后)其分子内的电子跃迁到较高能级轨道使分子进入激发态,激发态的分子不通过内部转换方式消耗能量回到基态,而是释放出相应较低能量的光量子→人眼可见的荧光(较长波长)。

   重庆荧光显微镜荧光现象有两种:一次荧光现象,又称“固有荧光”或“自发荧光”,是指经照射后,就能发出荧光的物质,此类物质的化学特征是发光分子具有共轭双键,π电子活动性大。二次荧光现象,又称“继发荧光”,物质经照射后不能或只能部分发生微弱的荧光,这样就需先用荧光色素(或称荧光染料、荧光探针)标记处理,将荧 光色素标记结合插入到不发光的活性分子中去,再经照射才能发生荧光。荧光色素应具备的基本条件是能与不发光分子的某个区域有特异性的牢固结合,同时不会影响被结合分子的结构和特性,光量子效率应≥013。

   荧光的产生包含了激发(Excitation)和发射(Emission)两个过程,激发光谱短于发射光谱,故光色不同。而不同的荧光物质或荧光色素有其最敏感而有效的激发波长,因此选择合适的激发/发射光谱以获得最佳的荧光镜像质量是实验中要首先考虑的。

   重庆荧光显微镜是利用“光化荧光”成像,如果所选激发波长在肉眼所看不见的近紫外光区(320~400nm),荧光的发射光谱也较普通光镜光源的平均波长短,光学分辨率提高。

重庆荧光显微镜